奥希替尼(osimertinib)、9291抑制egfr自体磷酸化的能力-

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摘要

G724s介导的富含甘氨酸的p-loop构象改变减少了奥希替尼(9291)与ex19del/g724s的结合亲和力,但没有减少到l858r/g724s,从而确定

  G724s介导的富含甘氨酸的p-loop构象改变减少了奥希替尼(osimertinib)(9291)与ex19del/g724s的结合亲和力,但没有减少到l858r/g724s,从而确定了g724s突变对ositinib结合的结构影响,我们对野生型egfr(wt)、ex19del(除非另有说明,典型变体e746_a750del)、ex19del/g724s、l858r和l858r/g724s进行了一系列高斯加速分子动力学(gamd)模拟。对我们初始模拟的分析表明g724s可能会延长p环骨架构象的波动。这些数据非常有趣,因为egfr先前已经被证明与奥希替尼(osimertinib)(9291)具有特点性的“弯曲”p-loop构象,我们假设g724s可能通过破坏奥希替尼(osimertinib)(9291)弯曲的p-loop构象而降低它的结合。以前关于蛋白质构象动力学的文献已经警告不要仅仅从rmsf统计推断功能机制。  

  因此,为了验证我们的假设,我们对ex19del,ex19del/g724s,l858r和l858r/g724s进行了可逆结合的模拟。我们同样用第二代,野生型选择性egfrtki,afatinib,作为对照,检查了这四个突变体。Afatinib在我们的研究中被选为对照,原理有很多。Afatinib以前曾被报道为一种潜在的医治药品,在ex19del/g724s介导的非小细胞肺癌的基础上患病者的病例报告。  

  类似于奥希替尼(osimertinib)(9291),afatinib是一种不可逆的egfr抑制剂,已经获得了医治egfr突变型肺癌的监管批准。奥希替尼(osimertinib)(9291)和afatinib都通过共价加合物形成不可逆地结合egfr。为了形成不可逆配合物,它们必须首先形成可逆的非共价配合物。可逆复合物形成的破坏有望降低加合物的形成。先前确定的egfr激酶化学结构可逆地与奥希替尼(osimertinib)(9291)结合,表明奥希替尼(osimertinib)(9291)结合是通过一个明确的“弯曲”p环构象来实现的。这种弯曲的p环构象使得f723苯环与奥希替尼(osimertinib)(9291)的吲哚环能量有利地接触,从而促进了它的亲和力。  

  我们模拟表明g724s通过稳定a弯构象使p环的尖端变得僵硬。l/g724s和l858r/g724s与奥希替尼(osimertinib)(9291)结合时不能形成稳定的弯曲p环构象。刚化的p环取代了f723与奥希替尼(osimertinib)(9291)的接触。有趣的是,我们发现了奥希替尼(osimertinib)(9291)结合的ex19del/g724s复合体稳定性减少的证据,但没有发现奥希替尼(osimertinib)(9291)结合的l858r/g724s复合体稳定性减少的证据。在我们的模拟中奥希替尼(osimertinib)(9291)维持了1-2000的rmd,与它在ex19del和l858r的天然结合位置相比。F723与奥希替尼(osimertinib)(9291)接触的位移与奥希替尼(osimertinib)(9291)rmsd在ex19del/g724s延长到3-4nm有关,而与l858r/g724s无关。相比之下,afatinib在所有四种情况下(ex19del、ex19del/g724s、l858r和l858r/g724s)形成稳定的可逆复合物。  

  这些模型表明,来自g724s的结构扰动,破坏了奥希替尼(osimertinib)(9291)的结合,未能显著影响afatinib的结合。这些数据支持阿法替尼(afatinib)在医治g724s患病者中的潜在作用,为了进一步研究这些差异,我们应用分子力学-广义玻恩表面积法(mm/gbsa)计算奥希替尼(osimertinib)(9291)与ex19del,ex19del/g724s,l858r,和l858r/g724s的结合自由能。我们的计算预测奥希替尼(osimertinib)(9291)结合自由能(gbind)与ex19del/g724s的2.3kcal/mol还原。我们的结合自由能计算还表明奥希替尼(osimertinib)(9291)可逆结合l858r比ex19del结合得更紧密1.9kcal/mol。为ex19del和l858r/g724s计算的奥希替尼(o
奥希替尼(osimertinib)、9291抑制egfr自体磷酸化的能力-
simertinib)(9291)结合自由能是无法区分的,在误差范围内,这表明在l858r中加入g724s突变导致的结合亲和力的减少不应该产生ositinib抗性。  

  此外,能量分解分析也支持我们的定性观察,即f723在ex19del和l858r中均有利于奥希替尼(osimertinib)(9291)结合(f723,gf723int,定义为gf723int=emm+gsolv,区别约为-1.8和-1.5kcal/mol),而且g724s的加入阻止了这种互相作用。基于晶体学证据的预测期望,我们的模拟显示f723对egfr与afatinib互相作用的贡献相当小。与fassunke等人一致,我们的afatinib相对结合自由能受g724s和奥希替尼(osimertinib)(9291)的影响较小。总之,这些数据表明g724s可能在ex19del/g724s对奥希替尼(osimertinib)(9291)起抗性突变作用,但不是在l858r/g724s。  

  Ex19del/g724s的体外表达与奥希替尼(osimertinib)(9291)的抗药性有关,而l858r/g724s的体外表达与奥希替尼(osimertinib)(9291)的抗药性无关。为了验证我们的模拟预测,我们首先检查了奥希替尼(osimertinib)(9291)抑制egfr自体磷酸化的能力。值得注意的是,迄今为止,在t790米的缺失和存在中都检查到了g724。因此,我们在实验研究中建立了所有可能性的模型。奥希替尼(osimertinib)(9291)能有效抑制表达ex19del和ex19del/t790m的293ft细胞的egfr自体磷酸化,但对表达ex19del/c797s或ex19del/t790m/c797s的293ft细胞无效,因为c797s突变曾被认为与ositinib抵抗有关。同样地,奥希替尼(osimertinib)(9291)也不能阻断egfrex19del/g724s和ex19del/t790m/g724s突变体的自体磷酸化。  

  我们还测试了奥希替尼(osimertinib)(9291)对l858r变异组合的治疗效果。与上述ex19del数据类似,奥希替尼(osimertinib)(9291)抑制l858r和l858r/t790m的磷酸化,而含有变异体(l858r/c797s和l858r/t790m/c797s)的c797s对该试剂不敏感。与ex19del变异数据相反,奥希替尼(osimertinib)(9291)可明显抑制l858r/g724s和l858r/t790m/g724s的磷酸化。这些数据与我们的模拟结果一致,模拟结果显示ex19del和l858r,在结合g724s突变时,药品结合特性有所不同。总的来说,这些数据表明g724s在ex19del的情况下起着抗性突变的作用,而不是l858r。接下来,我们试图定义一些策略来克服由g724s突变介导的奥希替尼(osimertinib)(9291)抗性。特殊是,我们侧重于野生型选择性egfrtkis的初期世代的功效。  

  已有研究表明,对奥希替尼(osimertinib)(9291)具有抗性的c797s基因突变体对第一代egfrtkis(erlotinib,gefitinib)具有敏感性。我们对含有g724s的egfr变体,也寻找了类似的策略。我们通过稳定转导ex19delegfr突变体到ba/f3细胞,并在多种抑制剂浓度下测量il-3-independent生长,定量评价了ex19del-series突变体上的几个tkis。不出所料,表达egfrex19del/c797s和egfrex19del/g724s的细胞生长对奥希替尼(osimertinib)(9291)不敏感。表达ex19del/c797s和ex19del/g724s的细胞系也对另一个突变体选择性egfr-tki,rockiletinib产生交叉抗性。表达ex19del/c797s的细胞对第一代egfrtkierlotinib的影响对比敏感,ec50与原始ex19del单一突变体(区别为16.12nm和13.71nm。  

  而ex19del/g724s突变体对厄洛替尼(erlotinib)的影响不敏感(ec50>1m)。我们的结构数据表明afatinib可能对ex19del/g724s双突变体保持效力。根据这些数据,表达这个双突变体的细胞的生长被29.63nmafatinib的ec50抑制。Afatinib对稳定转导的nr6细胞的ex19del/g724s自体磷酸化有明显的抑制作用,而erlotinib或奥希替尼(osimertinib)(9291)不起作用,而osiafinib和merb对l858r/g724s自体磷酸化有明显的抑制作用。  

  重要的是,之前的体外筛选未能确定g724s为耐受药物突变。我们的数据表明,这可能是因为这些屏幕产生了以wt,l858r,或l858r/t790m开头的错义突变体。我们的数据显示g724s在ex19del的情况下,起到了抗性突变的作用,而不是l858r。此外,我们的研究结果提供了额外的证据,表明afatinib,而不是奥希替尼(osimertinib)(9291)或erlotinib,可以有效地作为ex19del/g724s的抑制剂。奥希替尼(osimertinib)(9291)在老挝和孟加拉碧康都能够买得到的,详情请扫码咨询:

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